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植物病害生物防治那些事(一)

生防枯草芽孢杆菌

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类好氧的革兰氏阳性细菌(刘雪,2007),容易从自然界中分离。一些枯草芽孢杆菌具有显着的抗菌活性和极强的抗逆能力。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌中具有应用潜力的菌种之一,作为一类重要的生防资源,在防治植物的病害中发挥了重要作用(赵新林等, 2011)。

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生防枯草芽孢杆菌对植物病原菌的抑制作用机制

关于枯草芽孢杆菌作为生防因子的研究,主要集中在菌株的筛选和抗病效果上。近多年来,国内外科研工作者对其防病机理做了大量的工作,使其作用途径逐渐明晰。据报道,施用枯草芽孢杆菌后具有广谱防病作用。从目前的研究结果来看,枯草芽孢杆菌作为生防菌,其防病机制主要有拮抗作用、竞争作用、诱导植物抗性和促进植物生长等三个方面。

... 枯草芽孢杆菌作用机制

拮抗作用

主要指由于微生物的同化作用产生抗菌物质抑制有害病原物的生长或直接将病原物杀灭(程洪斌等,2006)。一般所产生的抗菌物质都是有机物质,物质种类多,作用范围广谱,它们在低浓度下就能对其他微生物的生长和代谢产生抑制效应。抑菌物质的作用途径主要包括以下几种:1、作用在病原菌的细胞壁上,产生几丁质酶、β-1.3-葡聚糖酶和蛋白酶,抑制细胞壁的形成(李然等,2008);2、作用于病原菌细胞膜上,损伤细胞质膜或者导致形成离子通道,引起菌体细胞内、外离子的不平衡,使离子外泄而导致细胞死亡使其受损,起到杀菌的目的(Sheppard et al.,1991);3、作用在蛋白质的合成系统上,大环内脂类物质和多烯类化合物可以阻碍原核生物蛋白质的合成(Zimmerman et al. 1987);4、作用在能量代谢上,造成病原菌的孢子及菌丝畸形,从而抑制病原菌的孢子萌发和菌丝的生长,甚至致使菌丝细胞膨大、破裂,从而使病原菌失去侵染能力(姬婧媛等,2015)。枯草芽孢杆菌能够产生60多种抗菌物质,迄今为止,国内外多家实验室通过分离纯化芽孢杆菌的发酵产物,得到了一些高分子量蛋白类的抗菌物质和低分子量的抗菌素(刘静等,2004)。

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枯草芽孢杆菌分泌的低分子量抗菌素主要有脂肽类抗生素、细菌素以及低分子抗菌肽等。非核糖体途径产生的脂肽类抗生素是枯草芽孢杆菌陈胜拮抗作用的主要成分,根据其结构上的差异可以分为伊枯草菌素(Tturin)家族、表面活性素(Surfactin)和Fengycin A、B,也包括一些结构未知的环肽抗生素。含有由亲水性氨基酸和疏水性脂肪酸链组成的特殊分子结构,表现出亲水、亲脂两亲性的特性。脂肽类抗生素抗菌作用的原理是其对细胞膜结构特性的影响,通过改变细胞膜通透性抑制病原菌的生长(Deleu et al.,2005).

伊枯草菌素是从一大类脂肽类化合物,家族成员包括Iturin A Mizumoto等(2007)、C、D、E,C,D,E,芽孢菌素(Bacillomycin) D、F、L以及抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)等(Maget-Dana et al.,1997;Stein et al.,2005)。它们疏水部分是一个C14-C17的β-氨基脂肪酸,亲水部分为肽链,是7个α-氨基酸通过脂肪酸的氨基与C-末端氨基酸的羧基形成的酰胺键成环(陈冠霞等,2013)。所有的枯草芽孢杆菌都可以产生伊枯草菌素,伊枯草菌素具有很好的溶血活性,对大多数致病酵母菌和霉菌具有强烈的抑菌能力,对于某些种类细菌也有抗菌性,如 藤 黄 微 球 菌(Micrococcus luteus)。其中以 Iturin A 的抗菌活性最强。Toure等(2004)研究发现了一株枯草芽孢杆菌可以产生伊枯草菌素,应用于苹果采后的真菌防治,能够有效地降低病害的发生。Mizumoto等(2007)发现含有伊枯草菌素A的发酵液可以有效防治灰葡萄孢引起的番茄猝倒病,同时也发现喷施伊枯草菌素A后可以有效防止土壤中的种子遭到病原菌的侵害,17d后土壤中检测不到伊枯草菌素A的存在,这说明相对于化学农药高残留而言对环境更友好。

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Arima等(1968)人首次发现枯草芽孢杆菌菌株能产生脂肽类表面活性剂,呈晶状,商品名为表面活性素(surfactin)。枯草芽孢杆菌产生的脂肽类生物表面活性剂是β-羟基脂肪酸和肽以内酯键结合,多肤中典型的氨基酸顺序为L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Val-L-Asp-D-Leu-L-Leu,分子量约为1000Da,具有抗菌、抗病毒和生物表面活性剂的作用(崔艳红等, 2006)。由于它极易与生物膜中的磷脂双分子层结合,破坏双分子层结构,从而达到抑菌、溶血的效果。钱常娣等(2011)通过盐酸沉淀、甲醇抽提法从枯草芽孢杆菌菌株 BAB-1发酵上清液中分离得到了一种脂肽类化合物,经过HPLC和TLC分离纯化后与表面活性素标准品物理特性一致,最后采用 PCR 扩增特异性片段 sfp 的方法证实该菌株有产生表面活性素的同源基因,同时提取到的表面活性素具有明显的溶血和排油活性,促进菌群扩展,促进生防菌株在植株表面的定殖。枯草芽孢杆菌B006菌株对黄瓜枯萎病具有较好的防治效果,根际施用的表面活性素含量越高,黄瓜枯萎病的病情指数越低,结果表明第一周防效可以达到70%以上,第五周时仍可以达到45.4%(贾珂,201)。

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Vanittanakom等人在Bacillus subtilis F2923菌株上通过纯化和分析后发现了一种抑制许多丝状真菌生长的脂肽类抗生素,并命名为Fengycin。Fengycin和Iturin不同,Fengycin 含有10个氨基酸形成的肽和1个C13-17的β-羟基脂肪酸链,其合成基因由fenC、fenD、fenE、fenA、fenB所组成(Loeffler et al.,1986;Vanittanakom et al.,1986)。Fengycin对丝状真菌Rhizopus stolonifer病菌丝状真菌,抑制机理主要包括破坏细胞膜,在脂膜上形成孔洞,使重要的内容物外泄阻止、破坏真菌细胞壁的合成,低浓度的Fengycin可以使Rhizopus stolonifer细胞发生凋亡,高浓度的Fengycin可以使Rhizopus stolonifer细胞发生死亡(唐群勇,2011)。在溶血作用方面,Fengycin没有伊枯草菌素和表面活性素强烈,但仍具用广谱的抗真菌活性和微弱的抑细菌活性(Moyne et al.,2001;Hiradate et al.,2002)。

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枯草芽孢杆菌分泌的高分子量的抗菌蛋白也是其具有拮抗活性的重要因素,抗菌蛋白作用机制包括抑制病原菌孢子萌发、菌丝皱缩、畸形,细胞壁溶解,以及原生质外泄等多种方式。

目前人们从部分拮抗细菌菌株中分离出蛋白类拮抗物质,主要包括一些酶类、抗菌蛋白和多肽类。枯草芽孢杆菌的分泌功能非常发达,从其整个基因组估算大约可合成4107种蛋白,预测其中有25%的蛋白是可输出胞外的。研究发现枯草芽孢杆菌能够产生几丁质酶、芽孢菌霉素D合成酶C(bacillomycin D synthetase C,309.04 kDa)、推断感应激酶(putative sensor kinase,53.38 kDa)、Bam D(44.94 kDa)、Ynf F(45.39 kDa)、推断反应调节因子(putative response regulator,27.74 kDa)、内切1-4-β-葡聚糖酶(endo-1-4-β-glucanase,46.60 kDa)、芽孢菌霉素D合成酶B(bacillomycin D synthetase B,607.23 kDa)、内切1-4-β-木聚糖酶(endo-1-4-β-xylanase,54.26 kDa)、芽孢菌霉素D合成酶A(bacillomycin D synthetase A,448.21 kDa)和Yxj F片段(12.23 kDa)等 (Moyne et al.,2004;Liu et al.,2007)。顾真荣等(2004)在枯草芽孢杆菌G3菌株的过滤上清液中得到几丁质酶,几丁质酶则强烈抑制孢子萌发并长久性地抑制芽管伸长。枯草芽孢杆菌C-D6菌株分离得到分子量为32 kD的蛋白,用该蛋白处理的孢子虽能完全萌发,但形成串珠状膨大的芽管和色浅、膨大的附着胞,并抑制芽管的正常生长(贾书娟等,2011)。另外对水稻多种致病菌具有抑制作用的枯草芽孢杆菌A30菌株及对多种植物炭疽病具有防治作用的内生枯草芽孢杆菌BS-2菌株分泌的抗菌物质为抗菌多肽(何青芳等,2002;何红等,2003)。

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竞争作用

竞争作用是指枯草芽孢杆菌与病原菌之间争夺生存环境内的生态位点、营养物质、氧气等的现象,通过削弱甚至排除方式,从而控制病原菌的生长,达到防止病害的效果(黄曦等,2010)。竞争的优势赋予了枯草芽孢杆菌更强的生活力。在枯草芽孢杆菌与病原菌具有相同的生态位点和相同时间内,枯草芽孢杆菌能够在植物体内迅速地定殖和繁殖,从而有效地降低了病菌和其毒素的积累(Bacon et al.,2001)。营养竞争是生防菌与病原物对植物分泌物、植物残体、根系脱落物等可利用的有限物质的争夺,这些物质中含有适合于微生物生长发育必需的碳水化合物、氨基酸、无机盐、维生素和次生代谢产物等。此外,营养竞争中还包括了对铁元素的竞争,铁是合成蛋白质的重要元素之一(陈石良等,2000),一些生防枯草芽孢杆菌可以产生嗜铁素,其是一种水溶性的色素,对Fe3+具有螯合作用,这样病原菌便会因缺铁而影响到生长发育(陈志文等,2002)。杜立新等(2004)通过扫描电镜观察表明,BS-208菌株在番茄叶面分布不均匀,大多定殖于伤口周围、叶面的凹陷处和绒毛的根部,并且都能够在自然土和灭菌土中定殖,自然土中的菌量低于在灭菌土中的菌量。杨秀荣等(2013)利用利用绿色荧光蛋白( Green fluorescent protein,GFP) 标记枯草芽孢杆菌 B579菌株检测其在黄瓜根部的定殖状况,结果表明B579-gfp在黄瓜根基部和中部有大量菌体聚集成膜状结构,浸种、蘸根以及灌根接种均可回收到大量的B579-gfp。

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诱导植物抗性和促进植物生长

外界的生物因素或者非生物因素可能会激发寄主植物产生物理方面或化学方面的抗菌生理反应(高学文等,2003),诱导植物抗性就是利用弱毒或者无毒的病原物或其他因素诱导植物产生抗性(董汉松等,1994)。近些年来生物防治研究领域中关于诱导抗性的研究发展的最为迅速,抗病机制主要包括诱导木质素形成和伸展蛋白(HRGP)的积累、诱导植保素(Phytoalexins)的沉淀、诱导病程相关蛋白PRP的产生、诱导酚物质的积累、诱导寄主防御酶活力(李晶,2010)。

目前大量研究发现诱导植物抗性也是枯草芽孢杆菌生防作用的重要机制之一。张先成等(2009)接种枯草芽孢杆菌B29菌株后测定黄瓜防御酶活性,结果显示能够诱导黄瓜根系苯丙氨酸解胺酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性的提高。在番茄苗上同时接种番茄灰霉病菌和生防菌枯草芽孢杆菌BS-208,接种48 h后番茄体内PAL、POD和PPO活性均升高,这些酶活性的升高增强了番茄抵御病原菌侵入的能力(杜立新等,2005)。何红等(2004)发现辣椒内生枯草芽孢杆菌BS-2对炭疽病菌菌丝生长、分生孢子产生与萌发均有很强的抑制作用,菌株培养液浸种,菌液浸种24h后播种20天,其苗的鲜重比清水对照增加了91.20%~138.04%,这说明BS-2菌株对辣椒还有明显的促生效果。